Fluorescenčni filter je bistven sestavni del fluorescenčnega mikroskopa.Tipičen sistem ima tri osnovne filtre: vzbujevalni filter, emisijski filter in dihroično zrcalo.Običajno so zapakirani v kocko, tako da se skupina skupaj vstavi v mikroskop.
Kako deluje fluorescenčni filter?
Vzbujevalni filter
Vzbujevalni filtri prepuščajo svetlobo določene valovne dolžine in blokirajo druge valovne dolžine.Uporabljajo se lahko za ustvarjanje različnih barv tako, da filter nastavijo tako, da prepušča samo eno barvo.Vzbujevalni filtri so na voljo v dveh glavnih vrstah - dolgoprepustni filtri in pasovni filtri.Vzbujevalnik je običajno pasovni filter, ki prepušča samo valovne dolžine, ki jih absorbira fluorofor, s čimer zmanjša vzbujanje drugih virov fluorescence in blokira vzbujevalno svetlobo v pasu emisije fluorescence.Kot prikazuje modra črta na sliki, je BP 460–495, kar pomeni, da lahko prehaja le skozi fluorescenco 460–495 n.
Postavljen je znotraj osvetlitvene poti fluorescenčnega mikroskopa in filtrira vse valovne dolžine svetlobnega vira, razen območja vzbujanja fluoroforja.Minimalna prepustnost filtra narekuje svetlost in sijaj slik.Priporočen je najmanj 40-odstotni prenos za kateri koli vzbujevalni filter, tako da je idealno prepustnost >85 %.Pasovna širina vzbujalnega filtra mora biti v celoti znotraj območja vzbujanja fluoroforja, tako da je središčna valovna dolžina (CWL) filtra čim bližje najvišji valovni dolžini vzbujanja fluoroforja.Optična gostota (OD) vzbujalnega filtra narekuje temnost slike ozadja;OD je merilo, kako dobro filter blokira valovne dolžine zunaj območja prenosa ali pasovne širine.Priporočena je najmanjša OD 3,0, idealna pa je OD 6,0 ali več.
Emisijski filter
Namen emisijskih filtrov je omogočiti, da želena fluorescenca iz vzorca doseže detektor.Blokirajo krajše valovne dolžine in imajo visoko prepustnost za daljše valovne dolžine.Tip filtra je prav tako povezan s številko, npr. BA510IF na sliki (filter za zaščito pred motnjami), ta oznaka se nanaša na valovno dolžino pri 50 % največjega prenosa.
Ista priporočila za vzbujevalne filtre veljajo za emisijske filtre: najmanjši prenos, pasovna širina, OD in CWL.Emisijski filter z idealno kombinacijo CWL, minimalnega prenosa in OD zagotavlja najsvetlejše možne slike z najglobljim možnim blokiranjem in zagotavlja zaznavanje najšibkejših emisijskih signalov.
Dikroično ogledalo
Dihroično zrcalo je nameščeno med vzbujevalnim in emisijskim filtrom pod kotom 45° in odbija vzbujevalni signal proti fluoroforju, medtem ko oddaja emisijski signal proti detektorju.Idealni dihroični filtri in cepilniki žarka imajo ostre prehode med največjim odbojem in največjim prenosom, z >95 % odbojem za pasovno širino vzbujalnega filtra in prenosom >90 % za pasovno širino emisijskega filtra.Izberite filter z upoštevanjem presečne valovne dolžine (λ) fluoroforja, da čim bolj zmanjšate razpršeno svetlobo in povečate razmerje med signalom in šumom fluorescentne slike.
Dihroično zrcalo na tej sliki je DM505, imenovano tako, ker je 505 nanometrov valovna dolžina pri 50 % največjega prenosa za to zrcalo.Prepustna krivulja za to zrcalo kaže visoko prepustnost nad 505 nm, strm padec prepustnosti levo od 505 nanometrov in največjo odbojnost levo od 505 nanometrov, vendar še vedno lahko nekaj prepustnosti pod 505 nm.
Kakšna je razlika med dolgoprepustnimi in pasovnimi filtri?
Fluorescenčne filtre lahko razdelimo na dve vrsti: dolgoprepustne (LP) in pasovne (BP).
Dolgoprepustni filtri oddajajo dolge valovne dolžine in blokirajo krajše.Mejna valovna dolžina je vrednost pri 50 % največjega prenosa, vse valovne dolžine nad mejno vrednostjo pa prenašajo dolgoprepustni filtri.Pogosto se uporabljajo v dihroičnih ogledalih in emisijskih filtrih.Dolgoprepustne filtre je treba uporabiti, kadar aplikacija zahteva največje zbiranje emisij in kadar spektralna diskriminacija ni zaželena ali potrebna, kar na splošno velja za sonde, ki ustvarjajo eno sevalno vrsto v vzorcih z relativno nizkimi stopnjami avtofluorescence v ozadju.
Pasovno prepustni filtri oddajajo samo določen pas valovnih dolžin in blokirajo druge.Zmanjšajo navzkrižni presluh, tako da omogočijo prenos samo najmočnejšega dela spektra emisij fluoroforja, zmanjšajo avtofluorescenčni šum in tako izboljšajo razmerje med signalom in šumom v vzorcih avtofluorescence z visokim ozadjem, česar filtri z dolgim prehodom ne morejo ponuditi.
Koliko vrst kompletov fluorescenčnih filtrov lahko dobavi BestScope?
Nekatere običajne vrste filtrov vključujejo modre, zelene in ultravijolične filtre.Kot je prikazano v tabeli.
| Set filtrov | Vzbujevalni filter | Dikroično ogledalo | Pregradni filter | Valovna dolžina LED svetilke | Aplikacija |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Metoda fluorescenčnih protiteles · Kislo oranžna: DNA, RNA ·Auramin: bacil tuberkuloze ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | · Rodamin, TRITC: Metoda fluorescenčnih protiteles ·Propidijev jodid: DNK · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | ·Avto-fluorescenčno opazovanje ·DAPI: barvanje DNK ·Hoechest 332528, 33342: uporablja se za barvanje kromosomov |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | · Kateholamini · 5-hidroksi triptamin · Tetraciklin: okostje, zobje |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Kompleti filtrov, ki se uporabljajo pri pridobivanju fluorescence, so zasnovani okoli glavnih valovnih dolžin, ki se uporabljajo v aplikacijah fluorescence, ki temeljijo na najpogosteje uporabljenih fluoroforjih.Zaradi tega so tudi poimenovani po fluoroforju, za katerega so namenjeni slikanju, kot so filtrske kocke DAPI (modra), FITC (zelena) ali TRITC (rdeča).
| Set filtrov | Vzbujevalni filter | Dikroično ogledalo | Pregradni filter | Valovna dolžina LED svetilke |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramin | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Teksaško rdeča | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Kako izberete fluorescenčni filter?
1. Načelo izbire fluorescenčnega filtra je omogočiti, da fluorescenčna/emisijska svetloba preide skozi slikovni konec, kolikor je to mogoče, in istočasno popolnoma blokirati vzbujevalno svetlobo, da se doseže najvišje razmerje med signalom in šumom.Zlasti pri uporabi večfotonskega vzbujanja in mikroskopa s popolnim notranjim odbojem bo šibek hrup povzročil tudi velike motnje slikovnega učinka, zato je zahteva za razmerje med signalom in šumom višja.
2. Spoznajte vzbujevalni in emisijski spekter fluoroforja.Za sestavo kompleta fluorescenčnih filtrov, ki ustvarja visokokakovostno visokokontrastno sliko s črnim ozadjem, morajo vzbujevalni in emisijski filtri doseči visoko prepustnost z minimalnim valovanjem prepustnega pasu na območjih, ki ustrezajo vrhom ali emisijam vzbujanja fluoroforja.
3. Upoštevajte vzdržljivost fluorescenčnih filtrov.Ti filtri morajo biti neprepustni za vire intenzivne svetlobe, ki ustvarjajo ultravijolično (UV) svetlobo, ki bi lahko povzročila "izgorelost", zlasti filtra vzbujevalnika, saj je izpostavljen polni intenzivnosti vira svetlobe.
Različne fluorescenčne vzorčne slike
Viri so zbrani in organizirani na internetu in se uporabljajo le za učenje in komunikacijo.Če pride do kakršne koli kršitve, se obrnite na nas za izbris.
Čas objave: 9. december 2022