Fluorescenčni mikroskop je vrsta optičnega mikroskopa, ki uporablja vir svetlobe visoke intenzivnosti za osvetlitev vzorca in vzbujanje fluorokromov v vzorcu. Osvetlitev preparata se običajno izvede s svetlobnim virom, ki oddaja ultravijolično svetlobo. Široko se uporabljajo na biološkem, medicinskem in industrijskem področju.
Kako deluje fluorescenčni mikroskop?
Fluorescenčni mikroskop uporablja živosrebrno ali ksenonsko žarnico za ustvarjanje ultravijolične svetlobe. Svetloba vstopi v mikroskop in zadene dihroično zrcalo - zrcalo, ki odbija en obseg valovnih dolžin in omogoča prehod drugemu območju. Dihroično ogledalo odbija ultravijolično svetlobo do vzorca. Nekateri primerki naravno fluorescirajo pod ultravijolično svetlobo, ker vsebujejo fluorescentne snovi, kot je klorofil. Če vzorec, ki si ga želite ogledati, naravno ne fluorescira, ga lahko obarvate s fluorescenčnimi barvili, imenovanimi fluorokromi.
Iz česa je sestavljen fluorescenčni mikroskop?
1. Vir svetlobe
Najpogostejši viri svetlobe so živo srebro, ksenon in LED. Živo srebro zagotavlja najboljšo kakovost svetlobe za fluorescenčni mikroskop. LED postajajo vse bolj priljubljene, ker so cenejše od drugih virov in porabijo manj energije.
| Živosrebrna svetilka | Xenon svetilka | LED | |
| Valovna dolžina oddane svetlobe | 350-370 nm | 400 nm ~ 450 nm | 400-700 nm |
| Življenjska doba (ura) | 200-300 | 400-600 | 10000 |
| Prednost | 1. Svetloba visoke intenzivnosti, najpogostejši viri svetlobe. 2. Oddaja močno ultravijolično in modro-vijolično, da vzbudi vse vrste fluoroforjev. 3. Svetle in barvite slike. | 1. Spektralna intenziteta je stabilna. 2. Močna spektralna intenzivnost v infrardečem in srednjem infrardečem območju. | 1. Enostaven za zamenjavo. 2. Ni potrebe po ogrevanju. 3. Lahko se vklopi in izklopi takoj. 4. Nadzor jakosti svetlobnega vira. |
| Slabost | 1. Kratka življenjska doba. 2. Dolg čas ogrevanja. | 1. Za odvečno toploto je potrebna posebna nizkonapetostna enosmerna napajalna omarica. 2. Dražje od živosrebrne sijalke | 1. UV svetloba je šibkejša od živosrebrne žarnice. 2. Vsaka valovna dolžina svetlobe zahteva ločeno LED zaradi ozkih pasovnih širin, ki jih oddajajo. |
Živosrebrni fluorescentni nastavek
LED fluorescentni nastavek
2. Vzbujevalni filter
Vzbujevalni filter je bistvenega pomena za delovanje fluorescenčnega mikroskopa. Prepušča svetlobo krajše valovne dolžine, ki bi jo fluorescentno barvilo lahko absorbiralo. Prav tako blokira druge vire vznemirljive svetlobe.
Vzbujevalni filter (B,G,U,V)
3. Dikroično ogledalo
Dihroično ogledalo je vrsta optičnega filtra, ki odbija svetlobo pri določenih valovnih dolžinah, druge pa prepušča. Uporablja se v fluorescenčnih mikroskopih za ločevanje valovnih dolžin vzbujanja in emisije.
4. Emisijski filter
Emisijski filter prepušča le valovne dolžine, ki jih oddaja fluorofor, in blokira vso neželeno svetlobo zunaj tega pasu – zlasti valovne dolžine vzbujanja.
5. Fluorescentna barvila
Fluorescentna barvila so organske spojine, ki imajo lastnost fluorescence, s katero lahko tvorijo fluorescentno sliko z oddajanjem zelo kontrastne vidne zelene svetlobe, potem ko jih vzbudi močna ultravijolična svetloba. Običajno uporabljena fluorescentna barvila so; DAPI (49,6-diamidino-2-fenilindol), akridin oranžna, auramin-rodamin, Alexa Fluors ali DyLight 488.
Koliko vrst fluorescenčnih mikroskopov?
1. Pokončni epifluorescenčni mikroskop:
Je najpogostejša vrsta fluorescenčnega mikroskopa. Vzbujanje fluoroforja in zaznavanje fluorescence potekata po isti svetlobni poti (tj. skozi objektiv). Večina fluorescenčnih mikroskopov, zlasti tistih, ki se uporabljajo v znanostih o življenju, ima epifluorescenčno zasnovo.
Raziskovalni fluorescenčni biološki mikroskop BS-2081F
2. Konfokalni fluorescenčni mikroskop:
Konfokalni fluorescenčni mikroskop: Ta vrsta fluorescenčnega mikroskopa združuje lasersko skeniranje s fluorescentno osvetlitvijo za ustvarjanje slike. Uporablja se lahko v številnih aplikacijah, kot je preučevanje celic in tkiv, odkrivanje beljakovin in drugih snovi v celicah ter merjenje debeline materialov.
Raziskovalni fluorescenčni biološki mikroskop BS-2081F
3. Invertni fluorescenčni mikroskop
Vir svetlobe in kondenzor pri tovrstnem mikroskopu sta nameščena na vrhu, obrnjena navzdol. Kot osvetlitve mora biti 90 stopinj glede na površino preiskovanega vzorca.
Invertni fluorescenčni mikroskop BS-2095F
Kakšne so prednosti in slabosti fluorescenčnih mikroskopov?
Prednosti:
- Omogoča opazovanje celic v živih organizmih, ne da bi jih poškodoval
- Zagotavlja slike visoke ločljivosti z natančnimi barvami
- Omogoča preučevanje živih procesov v celicah
- Uporablja se za identifikacijo različnih vrst molekul znotraj celic, kot so beljakovine ali nukleinske kisline.
Slabosti:
- Omogoča samo opazovanje specifičnih struktur znotraj celice, označene s fluorescentnim barvilom.
- Fotobeljenje zaradi vzbujanja elektronov med procesom fluorescence lahko vpliva na reaktivne molekule fluorescentnih barvil. Posledično lahko reaktivna barvila izgubijo svojo kemično lastnost intenzivnosti fluorescenčne emisije.
-Celice so dovzetne za fototoksični učinek po barvanju s fluorescenčnimi barvili, saj fluoroforne molekule absorbirajo fotone visoke energije iz svetlobe kratke valovne dolžine.
Kakšne so aplikacije fluorescenčnega mikroskopa?
Fluorescenčni mikroskopi se pogosto uporabljajo na različnih področjih raziskav in uporabe, vključno z biokemijo, celično biologijo, mikrobiologijo, imunologijo in medicino.
1. Na področju biologije fluorescenčni mikroskop omogoča natančno in podrobno identifikacijo celičnih in submikroskopskih celičnih komponent in aktivnosti s pomočjo označevanja s fluorescenčnim barvilom.
2. Na medicinskem področju lahko fluorescenčni mikroskop uporablja fluorescentne reagente za odkrivanje prisotnosti in porazdelitve bakterij in virusov ali za pomoč pri označevanju kirurških tarč za olajšanje operacije.
3. Na področju mineralogije se fluorescenčni mikroskop pogosto uporablja za preučevanje snovi s spontanimi fluorescenčnimi lastnostmi, kot so asfalt, nafta, premog, grafenov oksid in drugi minerali.
4. V znanosti o materialih se lahko fluorescenčni mikroskop uporablja v tekstilni ali papirni industriji za analizo materialov na osnovi vlaken.
Čas objave: 14. marca 2023